肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage, TAM）在恶性实体肿瘤内高度浸润，促进肿瘤演进和免疫抑制微环境形成。当下，靶向TAM的免疫治疗策略研发如火如荼的开展，包括阻断TAM募集、增强TAM吞噬、调控TAM极化和代谢重编程、嵌合抗原受体巨噬细胞（Chimeric antigen receptor-macrophage）疗法在内的临床试验逐年增加，但其治疗效果和转化价值仍相对有限。究其原因，与TAM来源、瘤内分布和表型的高度异质性有关。深入阐释TAM异质性和形成机制是研发靶向TAM肿瘤免疫治疗新策略的关键。恶性胶质瘤是中枢神经系统原发恶性肿瘤，抵抗常规治疗，复发率高，患者生存期短。恶性胶质瘤内TAM由外周单核细胞和脑组织驻留小胶质细胞极化而形成。与在瘤旁富集的小胶质细胞来源的TAM（microglia-derived TAMs，Mg-TAM）不同，单核细胞来源的TAM（monocyte-derived TAMs，Mo-TAM）多在胶质瘤瘤体内富集，且其含量增加与肿瘤复发和患者预后不良有关。然而，胶质瘤内不同空间区域的Mo-TAM是否存在表型异质性及其形成机制尚不清楚。重磅发现Identification of hypoxic macrophages in glioblastoma with therapeutic potential for vasculature normalization2024年4月18日，陆军军医大学第一附属医院（重庆西南医院）全军临床病理学研究所卞修武院士、时雨副教授、平轶芳教授（金凤实验室重庆先进病理研究院兼职PI）团队联合陆军军医大学第一附属医院脑胶质瘤医学研究中心、神经外科李飞副教授、华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授团队的祁淑红副研究员在Cancer Cell上发表了题为Identification of hypoxic macrophages in glioblastoma with therapeutic potential for vasculature normalization的研究论文，系统揭示了恶性胶质瘤内Mo-TAM的转录表型和空间分布异质性特征，鉴定出缺氧坏死微环境内富集的TAM缺氧亚群（Hypoxia-TAM）并证实其诱导微血管渗漏表型，阐明了靶向该亚群对胶质瘤血管正常化和提高抗肿瘤药物递送效率的治疗学意义。该研究包括以下主要发现：1. 利用单细胞多组学技术绘制了恶性胶质瘤Mo-TAM空间图谱，发现缺氧坏死区高度富集Hypoxia-TAM亚群该团队分析了51例人恶性胶质瘤内的36万个单细胞转录组数据，绘制了Mo-TAM的单细胞图谱；鉴定出具有缺氧响应、趋化运动、吞噬和抗原呈递、脂代谢依赖、干扰素产生、核糖体合成特征的Mo-TAM新功能亚群，并证实Mo-TAM多个亚群的转录特征在小鼠胶质瘤和多种人实体肿瘤中具有高度保守性；阐明了Mo-TAM亚群构成与胶质瘤类型、肿瘤级别、肿瘤分子变异和患者预后的相关性。他们还分析了35例人恶性胶质瘤空间转录组数据，建立了Mo-TAM不同亚群转录组特征与胶质瘤组织病理结构（血管富集区、缺氧坏死区和侵袭前沿区）的空间映射网络，绘制了Mo-TAM空间分布图谱，明确了不同Mo-TAM亚群在血管富集区、缺氧坏死区和侵袭前沿区的分布差异。他们利用多色免疫荧光成像，证实了Hypoxia-TAM亚群在胶质瘤缺氧坏死区高度富集，并解析了空间缺氧梯度与Hypoxia-TAM表型转化、胶质瘤细胞间质型转化、糖酵解代谢重编程和微血管增生的相关性。2. 阐明了缺氧坏死微环境诱导Hypoxia-TAM亚群表型极化的关键机制该团队利用体外人外周血单核细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞模型，分析了恶性胶质瘤缺氧坏死区内肿瘤因素和缺氧因素对诱导单核细胞向Hypoxia-TAM表型极化的影响。通过bulk转录组、蛋白质组和糖酵解代谢产物的整合多组学分析，系统筛选并鉴定出缺氧坏死微环境内胶质瘤细胞产生的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）和低氧诱导产生的乳酸是Hypoxia-TAM亚群极化的关键机制，证实两种因素协同诱导Mo-TAM内p50入核并增强Hypoxia-TAM核心表型基因转录。3. 发现Hypoxia-TAM是诱导恶性胶质瘤微血管高度渗漏的重要原因，建立了靶向Hypoxia-TAM以诱导胶质瘤血管正常化，提高抗肿瘤治疗药物递送和疗效的治疗新策略高度增生、高渗漏和低灌注的胶质瘤微血管是限制抗肿瘤药物递送和导致肿瘤细胞耐药的重要因素。鉴于恶性胶质瘤缺氧坏死灶周围大量富集新生的微血管，该团队进一步分析了Hypoxia-TAM对血管生成和微血管结构完整性的影响，发现Hypoxia-TAM能大量合成并分泌肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM），导致胶质瘤内微血管内皮细胞间的黏附连接破坏，进而引发血管高渗漏和血流低灌注。敲除Ccr2-Cre转基因小鼠中单核细胞及其衍生细胞内Adm，或采用ADM拮抗剂阻断ADM旁分泌通路，能抑制小鼠胶质瘤内血管生成，恢复内皮连接完整性并减少血管渗漏，从而诱导肿瘤内微血管结构正常化。他们在BRAF-V600E突变的人胶质母细胞瘤移植瘤中证实ADM拮抗剂与BRAF小分子抑制剂达拉非尼（Dabrafenib）联用，能增加达拉非尼的瘤内灌注，更有效地抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期。综上所述该研究利用单细胞多组学技术绘制恶性胶质瘤TAM空间图谱，鉴定出缺氧微环境内Hypoxia-TAM新功能亚群并阐明其形成机制，提出并建立了靶向拮抗Hypoxia-TAM旁分泌ADM以诱导胶质瘤血管正常化，提高抗肿瘤治疗药物灌注和疗效的治疗新策略。上述内容加深了我们对胶质瘤免疫微环境空间异质性特征和形成机理的认识，有望用于推动靶向胶质瘤内不同来源、不同功能TAM的免疫治疗新策略和抗肿瘤血管生成新策略的研发。陆军军医大学西南医院病理科（病理学研究所）硕士生王文英、博士生李天然和程玥，神经外科李飞副教授，华中科技大学武汉光电国家研究中心祁淑红副研究员为该论文的并列第一作者。陆军军医大学附属西南医院病理科（病理学研究所）卞修武院士、时雨副教授和平轶芳教授（金凤实验室重庆先进病理研究院兼职PI）为共同通讯作者。陆军军医大学第一附属医院神经外科冯华教授、胡荣教授，全军临床病理研究所刘新东教授（金凤实验室兼职PI）、王岩教授（金凤实验室兼职PI）、刘浩飞博士（金凤实验室研究员），华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授，陆军军医大学第二附属医院朱波教授（金凤实验室兼职PI）等也为这项研究提供了建议或技术指导。

放射治疗（RT）是局部控制三阴性乳腺癌症（TNBC）的重要临床治疗方法之一，但放射耐药性仍然限制着这一策略的治疗效果。鉴于此，陆军军医大学西南医院、金凤实验室卞修武院士、仰毅教授和田甘教授团队以双重放射增敏方式设计了一种ATP/pH双响应释放MOF基纳米药物，可有效递送铁离子并抑制谷胱甘肽（GSH）的合成从而协同诱导铁死亡，结合高原子序数纳米材料的放疗增敏效应，共同促进了TNBC的放射治疗效果。该研究以题为“A MOF-based Potent Ferroptosis Inducer for Enhanced Radiotherapy of Triple Negative Breast Cancer”的论著形式发表在《ACS Nano》上。该纳米材料合成过程如图1所示。首先通过一步法将L-丁硫氨酸-亚砜亚胺（BSO）负载于ZIF-8内，然后在其表面生长金纳米粒子（AuNPs）。以BSO/ZIF-8@Au为模板，生长铁基金属多酚（MPN）网络结构，最后修饰透明质酸（HA）获得最终纳米材料BSO/ZIF-8@Au@MPN@HA(BZAMH)。BSO可抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS），减少胞内GSH的生物合成，从而间接灭活GPX4。MPN释放的Fe2+可通过芬顿效应产生羟基自由基（•OH）。GPX4的失活和局部生成•OH共同诱导强效铁死亡。修饰后的Au NPs可改善入射X射线的能量沉积。各组分协同促进铁死亡并增强RT以有效治疗TNBC，同时抑制TNBC肺转移（图1B）。▲图1. MOFs基铁死亡纳米诱导剂的合成路线及作用机理图【BZAMH NPs的物理化学性质表征】所制备的BZAMH NPs呈现空心球状结构，水合粒径约为200nm。当生长了MPN壳层之后，由于TA的刻蚀与还原作用，BZAMH NPs转化为非晶态空心结构，并且表面的铁离子以Fe2+居多，为后续的芬顿反应提供了有利条件。▲图2. BZAMH NPs的物理化学性质表征【BZAMH NPs可有效诱导铁死亡】BZAMH NPs消耗细胞GSH和放大氧化应激诱导铁死亡。实验以4T1小鼠细胞为模型，证明了BZAMH NPs可被细胞有效内吞，并能成功消耗细胞内的GSH，下调GPX4表达，造成脂质过氧化物（LPO）的累积，从而诱导明显的铁死亡效应。▲图3. BZAMH NPs可有效诱导铁死亡【铁死亡可与Au NPs协同增强RT】铁死亡可增强RT，并与Au介导的放射增敏作用协同。实验证明了铁死亡和Au NPs都可以明显促进RT对肿瘤细胞的抑制作用，BZAMH NPs可以协同两者的作用，造成更明显的DNA损伤，表现出最强的细胞生长抑制作用。▲图4. 铁死亡可与Au NPs协同增强RT【体内抗肿瘤实验】BZAMH NPs在体内表现出明显的肿瘤生长抑制作用。基于体外治疗的研究结果，我们进一步研究了BZAMHNPs在体内的抗肿瘤作用。实验表明，BZAMH+X-ray介导的铁死亡和RT具有最明显的肿瘤生长抑制效果，延长了小鼠的生存期。对肿瘤组织进行切片染色发现，BZAMH+X-ray可以显著降低Ki67和GPX4的表达，造成严重的DNA损伤，从而成功抑制细胞增殖和肿瘤生长。▲图5. BZAMH NPs体内抗肿瘤实验【抗肺转移研究】采用血流转移和乳腺癌原位肺转移双模型研究了BZAMHNPs的抗转移能力。血流模型研究发现，BZAMH+X-ray可以明显抑制小鼠肺部肿瘤结节的产生；乳腺癌原位肺转移模型研究发现，BZAMH+X-ray不仅可以抑制原位肿瘤的生长，同样可以减少乳腺癌肺转移的情况发生。▲图6. 抗肺转移研究【小 结】该研究开发了一种MOFs基纳米药物，可控递送亚铁离子以引发类芬顿效应以执行铁死亡，且可抑制GSH生成使得GPX4失活以破坏铁死亡防御系统，二者协同诱导强烈的铁死亡。结合AuNPs的放疗增敏效应，高效抑制肿瘤的生长同时表现出更强的抗乳腺癌肺转移疗效。总之，本研究引入的智能纳米药物为抗癌治疗提供了新的见解，有望为下一代纳米药物的发展提供可靠的参考。

“2023年3月23日，来自陆军军医大学第一附属医院、金凤实验室的刘新东、卞修武、王岩团队和第二附属医院的吕胜青团队在CancerCell上在线发表题为Neutralizing IL-8 potentiates immune checkpoint blockade efficacy for glioma的文章，揭示了IL-8在构筑脑胶质瘤免疫抑制微环境中的作用及作为免疫治疗靶点的潜在应用价值，为脑胶质瘤的免疫治疗提供了新的见解。”肿瘤浸润T细胞的功能状态是决定抗肿瘤免疫应答和免疫治疗响应的关键因素。在多数情况下，肿瘤浸润T细胞越多提示抗肿瘤免疫应答水平越强。然而，胶质瘤微环境中的T细胞含量随着肿瘤等级的升高而升高，提示胶质瘤T细胞功能的多样性。最新的研究表明，脑胶质瘤中发生克隆扩增的肿瘤特异性T细胞主要包括耗竭、效应和记忆三种亚群【3】，然而肿瘤中其余非克隆扩展的T细胞的功能尚不清楚。本文研究人员首先通过组织学分析了脑胶质瘤中T细胞的分布，发现T细胞主要分布在血管周，基于Ivy GAP数据库的分析也证明了这一结论。为进一步探究介导T细胞向肿瘤组织迁移的趋化因子受体，作者利用质谱流式（CyTOF）比较分析了脑胶质瘤病人外周血和肿瘤组织中趋化因子受体的表达情况，发现肿瘤浸润T细胞高表达趋化因子受体CCR5和CXCR3，提示这两种受体参与介导T细胞向肿瘤的迁移。为了系统的分析肿瘤微环境中T细胞的功能状态，作者对脑胶质瘤病人血液和肿瘤的T细胞进行了单细胞测序并比较分析，发现肿瘤浸润T细胞包含了18个亚群包含了7个CD4+T细胞亚群、10个CD8 T细胞亚群以及一个γδ T细胞亚群。值得注意的是，作者在肿瘤CD4+ T细胞中发现了一个高表达IL-8的亚群（Th8）。Th8的TCR克隆水平低，提示为非肿瘤特异性T细胞，高表达IL8、IL1B、CCL3等分泌性因子以及转录因子BHLHE41，并与病人生存负相关。鉴于Th8只存在于肿瘤组织中，作者推测肿瘤细胞分泌的因子诱导Th8的形成。为验证这一猜想，作者用脑胶质瘤肿瘤原代细胞培养上清诱导健康人初始CD4+T细胞，发现肿瘤细胞培养上清能够诱导T细胞释放IL-8，并且经过肿瘤上清诱导的T细胞和体内的Th8细胞具有相似的转录谱特征，表现出先天性免疫细胞的特性。通过体内外试验，作者证明肿瘤上清诱导的T细胞具有募集髓系抑制细胞（MDSC）和促进血管形成的能力。为了进一步探究Th8细胞分化形成的内在调控机制，作者在T细胞中过表达了一系列转录因子，结果显示过表达BHLHE41能够强烈的诱导T细胞表达IL-8，后续的功能实验表明过表达BHLHE41的T细胞具有类似Th8的特征。然而当作者利用Crispr-cas9敲除BHLHE41时，并没有发现IL-8的下调，这说明BHLHE41是CD4+T细胞表达IL-8的充分非必要条件。临床上，血清IL-8水平与病人肿瘤负荷正相关，与ICB治疗效果负相关【4,5】。然而由于啮齿动物基因组中不含有IL8基因，IL-8在肿瘤发生过程中的免疫调节功能尚不清楚。为在体内探究IL-8的免疫调节功能，作者构建了IL-8全人源化小鼠（IL8-Hu）。脑胶质瘤在IL8-Hu小鼠体内的生长速度更快，肿瘤组织中含有更多的MDSC，且具有与临床样本相似的病理组织学特征。anti-PD-1单药治疗不能抑制肿瘤在IL8-Hu小鼠上的生长。进一步研究发现，PD-1阻断治疗使肿瘤组织和血清中IL-8水平升高，导致肿瘤组织中MDSC浸润增多。这一现象驱使作者进行IL-8和PD-1的联合阻断治疗。与预期相符，IL-8和PD-1的联合治疗几乎阻断了MDSC向肿瘤的募集，抑制肿瘤血管新生，降低T细胞耗竭，显著延长小鼠生存期。为更加全面的探究IL-8阻断治疗对肿瘤免疫微环境的影响。作者对不同处理的小鼠进行了单细胞测序分析。与前期的发现一致，阻断IL-8后肿瘤中的MDSC显著减少。通过对单核细胞源巨噬细胞（MDM）和小胶质细胞的聚类分析，作者发现阻断IL-8后肿瘤中M2型巨噬细胞和免疫抑制性小胶质明显减少，而抗血管生成MDM增多。这说明阻断IL-8改变了巨噬细胞和小胶质细胞的分化轨迹，逆转了肿瘤免疫抑制微环境。综上所述，本文利用多组学的研究手段揭示了脑胶质瘤中T细胞的分布特点和功能特征。发现并鉴定了一群高表达IL-8的CD4+ T细胞（Th8）。Th8细胞通过释放IL-8，与肿瘤细胞和髓系细胞一道构筑肿瘤免疫抑制微环境。阻断IL-8能够逆转肿瘤的免疫抑制微环境，增强免疫检查点阻断的治疗效果（图1）。图1.图文总结陆军军医大学第一附属医院、金凤实验室刘新东教授、卞修武院士、王岩教授和陆军军医大学第二附属医院吕胜青教授为论文共同通讯作者。陆军军医大学第一附属医院、金凤实验室的刘浩飞博士为第一作者。参考文献1Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Current state ofimmunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol15, 422-442 (2018).https://doi.org:10.1038/s41571-018-0003-52Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P. & Wargo, J. A. Hallmarks ofresponse, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade.Cell184, 5309-5337 (2021). https://doi.org:10.1016/j.cell.2021.09.0203Mathewson, N. D.et al.Inhibitory CD161 receptor identified inglioma-infiltrating T cells by single-cell analysis. Cell184, 1281-+(2021). https://doi.org:10.1016/j.cell.2021.01.0224Yuen, K. C.et al.High systemic and tumor-associated IL-8 correlateswith reduced clinical benefit of PD-L1 blockade. Nat Med26, 693-698(2020). https://doi.org:10.1038/s41591-020-0860-15Schalper, K. A.et al.Elevated serum interleukin-8 is associated withenhanced intratumor neutrophils and reduced clinical benefit ofimmune-checkpoint inhibitors. Nature Medicine26, 688-+ (2020).https://doi.org:10.1038/s41591-020-0856-x